摘要：為探究浙江省舟山市某養(yǎng)殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴發(fā)疾病的病因,應(yīng)用組織病理學(xué)、分子生物學(xué)和熒光原位雜交等技術(shù)手段,對(duì)患病三疣梭子蟹組織進(jìn)行檢驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn),患病三疣梭子蟹的臨床癥狀主要表現(xiàn)為食欲下降,行動(dòng)遲緩,鰓水腫;光學(xué)顯微鏡下觀察鰓及血淋巴液未發(fā)現(xiàn)寄生蟲,肝胰腺等組織中也未分離到致病菌;采用PCR方法對(duì)病蟹進(jìn)行血卵渦鞭蟲(hematodinium)、白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、青蟹雙順反子病毒(mud crab discistrovirus-1,MCDV-1)以及青蟹呼腸孤病毒(Scylla serrata reovirus,SSRV)蟹類常見病原PCR檢測(cè),結(jié)果均為陰性;病蟹的肝胰腺、心臟、鰓等組織的病理切片中可觀察到明顯的細(xì)胞病變和嗜酸性包涵體;超薄切片電鏡觀察顯示:病蟹的肝胰腺、心臟和鰓組織中均存在六邊形病毒顆粒,粒子直徑150nm左右,與已報(bào)道的十足目虹彩病毒1 (decapoda iridescent virus 1,DIV1)形態(tài)特征相似。采用特異性套式PCR檢測(cè)方法對(duì)患病蟹組織樣品進(jìn)行DIV1病原檢測(cè),所有樣本均擴(kuò)增出457 bp和129 bp大小的目的片段。進(jìn)一步根據(jù)Gen Bank中DIV1的主要衣殼蛋白(major capsid protein,MCP)表達(dá)基因和三磷酸腺苷酶(ATPase)表達(dá)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,均能從病蟹樣品中擴(kuò)增出預(yù)期大小的MCP和ATPase基因開放閱讀框(open reading frame,ORF)區(qū)全長(zhǎng)。將擴(kuò)增獲得的MCP和ATPase基因ORF區(qū)全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序和同源序列比對(duì)分析,進(jìn)化樹分析結(jié)果表明其與十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)病毒的MCP和ATPase基因序列自然聚為一支,判定導(dǎo)致此次三疣梭子蟹發(fā)病病原為DIV1。根據(jù)原位雜交探針設(shè)計(jì)原則,以DIV1的MCP和ATPase基因的保守區(qū)域?yàn)榘形稽c(diǎn)分別設(shè)計(jì)探針,通過熒光原位雜交獲得了病毒粒子在病蟹肝胰腺、心臟、肌肉和鰓組織的分布情況,與電鏡切片觀察和套式PCR檢測(cè)結(jié)果相符。研究結(jié)果可為海水養(yǎng)殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1病診斷與防控提供參考。
